Rok 1953 przyniósł kolejne istotne wydarzenie dla głównej siedziby Muzeum – wpis do rejestru zabytków. W zaktualizowanej wersji planu zagospodarowania postanowiono przeznaczyć parter na ekspozycję wykopalisk archeologicznych, pamiątek bydgoskich, militariów oraz wystawę dzieł urodzonego w Bydgoszczy artysty – Maksymiliana Antoniego Piotrowskiego. Na pierwszym piętrze ulokowana została galeria malarstwa polskiego XIX i XX w. oraz ekspozycja prac Leona Wyczółkowskiego. Do lat 60. XX w. w znaczącym stopniu przeprowadzono wiele poważnych prac remontowych. Budynek został na nowo otynkowany, wykonano naprawę dachu. Wewnątrz usunięto zbędne drzwi i wybito dostosowane do sal ekspozycyjnych przejścia, a także wymieniono część posadzek. Muzeum otrzymało ponadto centralne ogrzewanie, przy okazji zdemontowano zbędne w takiej sytuacji piece kaflowe. Zmodernizowano również instalację elektryczną i zamontowano nowe oświetlenie. Ciekawym pomysłem, który pojawił się w drugiej połowie lat 50. XX w. była koncepcja rozbudowy obiektu. Nieustanny rozrost zbiorów i popularność Muzeum była jednym z głównych powodów tych śmiałych planów. Do starego budynku zamierzano dobudować dużą, dwukondygnacyjną bryłę. Na rozbudowę kompleksu przy al. 1 Maja 4 (ob. ul. Gdańska 4) bydgoskie Muzeum musiało jednak poczekać aż do XXI w.
Tragiczny pożar, który wybuchł w Spichrzach nad Brdą przy ul. Grodzkiej w nocy z 5 na 6 lutego 1960 r. doszczętnie zniszczył dwa z pięciu zabytkowych, pochodzących z przełomu XVIII i XIX w. budynków (te położone najdalej od Mostu Staromiejskiego na Brdzie). W tym momencie zdano sobie sprawę, że należy zadbać o odpowiednie zabezpieczenie uratowanych od ognia pozostałych trzech spichrzy. Rozpoczęły się konsultacje społeczne i debata na najwyższym szczeblu władz miasta. Ostatecznie zdecydowano, że dwa z nich (numer 9 i 11) zostaną przekazane do dyspozycji Muzeum im. Leona Wyczółkowskiego. Trzeci miał pełnić przez jakiś czas inną funkcję. Podobnie jak w przypadku gmachu przy al. 1 Maja, tak i również tutaj potrzebna była gruntowna modernizacja i adaptacja budynków. Prace przeprowadzane do jesieni 1964 roku obejmowały między innymi: budowę klatki schodowej, wymianę stropów i dachów, stworzenie od podstaw instalacji – elektrycznej, wodno-kanalizacyjnej i centralnego ogrzewania. Nowa przestrzeń stała się miejscem pracy Działu Archeologii i Działu Historii, a później także utworzonego Działu Numizmatycznego. Początkowo wydzielono siedem sal ekspozycyjnych, z których cześć została później zamieniona na magazyny, co było spowodowane zmieniającymi się trendami wystawienniczymi, odchodzeniem od eksponowania większości posiadanego inwentarza na rzecz organizowanych regularnie wystaw czasowych.
11 czerwca 1955 r. do Muzeum zwrócił się dyrektor Bydgoskiego Przedsiębiorstwa Aptek z propozycją urządzenia ekspozycji naczyń aptecznych. Po wstępnych rozmowach ustalono, że należy zebrać wszystkie posiadające wartość historyczną przedmioty, takie jak zabytkowe puszki, naczynia, moździerze, przyrządy oraz XIX-wieczne książki z aptek znajdujących się w całym województwie bydgoskim. Do Muzeum dostarczono kilkadziesiąt eksponatów. Dzisiaj stanowią one integralny element wystawy stałej w Aptece „Pod Łabędziem” przy ul. Gdańskiej 5. W tym samym okresie „Gazeta Pomorska” przekazała do zbiorów bydgoskiej instytucji jeden z obrazów Jacka Malczewskiego pt. Przebudzenie, odnaleziony w Żninie. Co interesujące, w sprawie zwrotu dzieła interweniowało Prezydium Powiatowej Rady Narodowej w Żninie, tłumacząc, że obraz ten przeznaczony był do oddania do muzeum w Toruniu, a pracownicy Domu Kultury w Żninie, nie posiadając odpowiednich wytycznych, wydali go w ręce bydgoskiego Muzeum. Co czyni sytuację jeszcze bardziej złożoną, urząd w Żninie dwa dni po wydaniu obrazu do Bydgoszczy otrzymał list z Ministerstwa Kultury i Sztuki z dyspozycją przekazania go Muzeum Narodowemu w Poznaniu. Szczęśliwie jednak pozostał już w zbiorach bydgoskiego muzeum.
W pierwszej połowie lat 50. XX w. uformowały się pierwsze cztery działy merytoryczne: Dział Sztuki Polskiej, Dział Leona Wyczółkowskiego, Dział Archeologii oraz Dział Historii. Najwięcej ekspozycji indywidualnych w tym czasie poświęcono twórczości patrona Muzeum, Leona Wyczółkowskiego. Były to wystawy prezentowane nie tylko w Bydgoszczy, ale także na terenie muzeów i sal wystawienniczych w całym kraju. Pierwsza ekspozycja dotycząca w całości numizmatów została zorganizowana dopiero w 1961 r. i była częścią wieloletnich obchodów tysiąclecia państwa polskiego. Zaprezentowano na niej monety polskie ze zbiorów Muzeum. Po wydzieleniu osobnego, specjalistycznego gabinetu, a potem utworzeniu osobnego działu, rozpoczęto organizację tematycznych wystaw na szerszą skalę. Od początku lat 60. XX w. można zauważyć, że tematyka wystaw stała się bardziej różnorodna.