W latach 30. XX w. rozpatrywana była możliwość budowy nowej siedziby, która mogłaby pomieścić całość zbiorów Muzeum: magazyny, biura oraz stałe i czasowe ekspozycje. W tym czasie pojawiła się po raz pierwszy koncepcja przekazania dla Muzeum budynku przy ul. Gdańskiej 4. Wówczas nie doczekała się ona realizacji.
Do jednego z najważniejszych wydarzeń w historii Muzeum doszło w 1937 r. Pozyskano wówczas bogatą kolekcję prac i pamiątek osobistych po Leonie Wyczółkowskim, przekazanych przez Franciszkę Wyczółkowską, wdowę po malarzu. Wśród nich znalazły się m.in.: prace olejne, akwarele, grafiki, rysunki, pamiątki osobiste (w tym odznaczenia) oraz przedmioty stanowiące wyposażenie pracowni artysty – w sumie 942 pozycje. Ten związany pod koniec swojego życia z regionem malarz wybrał bydgoską placówkę jako miejsce, dzięki któremu pamięć o nim i jego pracy zostanie zachowana. W akcie darowizny napisano:
Profesorowa Franciszka Wyczółkowska, pragnąc dać wyraz serdecznym uczuciom, które żywił dla miasta Bydgoszcz mąż jej, śp. Prof. Leon Wyczółkowski oraz pragnąc stworzyć stały pomnik jego wielkiej sztuce, daruje niniejszym na wieczystą i wyłączną własność miasta Bydgoszczy prace i zbiory Prof. Leona Wyczółkowskiego ujęte w spisie stanowiącym integralną część aktu darowizny.
W związku z rozrostem zbiorów, podjęto starania w urzędzie miasta o poszerzenie bazy lokalowej Muzeum. Zdecydowano wówczas o przekazaniu na cele wystawiennicze gmachu dawnego Internatu Kresowego (ob. ul. Chodkiewicza 32).
Muzeum sprowadzało na wystawy obiekty z całego kraju. Jedną z wystaw tego typu była ekspozycja Współczesne medale belgijskie (1935). W Muzeum Miejskim pokazywano także prace lokalnych artystów. Pierwsza edycja Salonu Bydgoskiego odbyła się w 1936 r. W kolejnych latach wydarzenie to stało się corocznym elementem prezentacji osiągnięć miejscowego środowiska artystycznego. Od 1923 r. do 1939 r. zaprezentowano około 120 wystaw czasowych, w większości dotyczących sztuk plastycznych.
Napięta sytuacja międzynarodowa pod koniec lat 30. XX w. spowodowała zmianę muzealnych priorytetów. Zamiast myślenia o dalszym rozbudowywaniu zasobów należało zastanowić się nad tym, w jaki sposób uchronić przed wojną zgromadzoną kolekcję. W sierpniu 1939 r., kiedy zagrożenie zdawało się zbliżać nieuchronnie, rozpoczęto zabezpieczanie najcenniejszych zabytków. W celu ochrony muzealiów przygotowano skrzynie, do których pakowano eksponaty. Większość z nich pozostawiono w gmachu Muzeum przy Starym Rynku, sam budynek zaś został zabezpieczony i zamknięty.
5 września 1939 r. Bydgoszcz została zajęta przez wojska niemieckie. Po zajęciu miasta przez wojska okupacyjne doszło do krwawej pacyfikacji miasta.. Sama placówka (jako Stadtmuseum Bromberg) pracowała nadal, pozostając własnością miasta. Szczęściem w nieszczęściu było uznanie bydgoskich zbiorów i samej placówki za niemieckie, co oznaczało, że znajdowały się one pod ochroną i nie była dopuszczona ich grabież czy też wywożenie do innych placówek niemieckich.
W 1940 r. Muzeum utraciło swoją siedzibę. Zgodnie z decyzją władz niemieckich wyburzono zachodnią część Starego Rynku, włącznie z pojezuickim kościołem p.w. św. Ignacego Loyoli. Dla zbiorów instytucji rozpoczął się okres tułaczki. Jako pierwsze miejsce tymczasowego przechowywania został wyznaczony budynek przy Burgstraße 1 (ob. Dom Polski, ul. Grodzka 1). Przeniesienie zabytków miało miejsce na przełomie listopada i grudnia 1939 r. Nieco później lokal został wytypowany do pełnienia roli sali muzyki kameralnej, stąd kierownictwo Muzeum stanęło przed zadaniem znalezienia nowego lokalu. Wybrano dawną rezydencję prezydenta rejencji bydgoskiej, podczas wojny mieszczącą się pod adresem Hermann Göring Straße 8-10 (ob. ul. Marszałka F. Focha 25). Sporządzono dokumentację techniczną, kosztorys, a nawet zaprojektowano wyposażenie. Śmiałe plany nie zostały zrealizowane, a działalność wystawiennicza została ograniczona do minimum.
Wystawy realizowane w pierwszych latach okupacji w Bydgoszczy odbywały się w wielu miejscach i miały one spełniać rolę propagandową. Pierwszą z nich była wystawa Deutsche Kunst im Braheland, którą zrealizowano w 1941 r. w sali Zivilkasino (Kasyna Cywilnego) przy Adolf-Hitler-Straße 20 (ob. ul. Gdańska 20). Prezentowała ona wybrane dzieła artystów z Bydgoszczy i okolic. W roku kolejnym przygotowano ekspozycję Bromberger Kunstausstellung 1942 w auli Königliche Gymnasium (ob. I Liceum Ogólnokształcące) na Weltzienplatz (ob. Plac Wolności).